2019年11月19日，北京市臨床檢驗(yàn)中心、北京醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)分會(huì)、首都醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)系、北京市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)質(zhì)量控制和改進(jìn)中心牽頭制定了《高通量測(cè)序技術(shù)臨床檢測(cè)規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識(shí)（第一版通用部分）》（以下簡(jiǎn)稱“通用共識(shí)”）［3］。隨后，為規(guī)范實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)，在借鑒相關(guān)指南、規(guī)范及權(quán)威發(fā)表的文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，專家組起草了《高通量測(cè)序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識(shí)（第一版腫瘤部分）》［1］，于2020年3月10日在《中華醫(yī)學(xué)雜志》正式發(fā)布。
隨著個(gè)體化醫(yī)學(xué)的發(fā)展和“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”概念的提出，腫瘤藥物治療發(fā)展迅速，臨床研究逐漸發(fā)現(xiàn)并證實(shí)更多與藥物治療療效預(yù)測(cè)相關(guān)的基因突變。高通量測(cè)序技術(shù)因其在通量、成本和效率方面的優(yōu)勢(shì)，已在實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。然而，實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)中，低頻突變、腫瘤異質(zhì)性、樣本種類多樣、樣本質(zhì)量差別較大等均給實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)帶來了挑戰(zhàn)，因此其在方法建立、分析前、中、后質(zhì)量控制等方面均有其特殊之處。
8點(diǎn)共識(shí)，規(guī)范腫瘤體細(xì)胞突變NGS檢測(cè)的臨床應(yīng)用
《高通量測(cè)序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識(shí)（第一版腫瘤部分）》包括實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的總體要求和檢測(cè)流程的建立與質(zhì)量保證兩大部分，共達(dá)成8點(diǎn)專家共識(shí)，覆蓋體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、實(shí)驗(yàn)室人員及能力要求，以及檢測(cè)項(xiàng)目的臨床預(yù)期用途確定、NGS方法學(xué)建立與優(yōu)化、LDTs性能確認(rèn)、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)SOPs的建立即分析前中后的質(zhì)量保證關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)進(jìn)一步規(guī)范化開展腫瘤體細(xì)胞突變NGS檢測(cè)的臨床應(yīng)用，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率和穩(wěn)定性，幫助臨床診療具有重大意義。
共識(shí)1
實(shí)體腫瘤體細(xì)胞突變檢測(cè)通常分析敏感性較高，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)尤其注意合理分區(qū)，以防止污染。雜交捕獲法NGS建議的分區(qū)包括試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備前區(qū)、樣本制備區(qū)、打斷區(qū)、電泳區(qū)、文庫制備區(qū)、擴(kuò)增一區(qū)、雜交捕獲區(qū)、擴(kuò)增二區(qū)和測(cè)序區(qū)。但是不同檢測(cè)流程，分區(qū)設(shè)置有所不同，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)“通用共識(shí)”的“32字原則”來考慮實(shí)驗(yàn)室分區(qū)設(shè)置。若實(shí)驗(yàn)室同時(shí)檢測(cè)血漿和組織或細(xì)胞學(xué)兩類樣本，則需設(shè)置不同的樣本制備區(qū)及其后續(xù)的文庫制備過程中的相應(yīng)區(qū)域。
共識(shí)2
NGS實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或技術(shù)負(fù)責(zé)人應(yīng)有全面的NGS及其實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理知識(shí)。采用組織樣本進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，“濕實(shí)驗(yàn)”團(tuán)隊(duì)成員應(yīng)包括病理醫(yī)（技）師人員。生物信息學(xué)分析團(tuán)隊(duì)中應(yīng)有具備臨床腫瘤學(xué)和臨床分子檢測(cè)基本知識(shí)的人員。簽發(fā)報(bào)告人員應(yīng)具備醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)和臨床腫瘤學(xué)知識(shí)背景，熟練使用相關(guān)數(shù)據(jù)庫，掌握本領(lǐng)域的指南，了解相關(guān)研究的最新進(jìn)展。對(duì)于疑難病例或必要時(shí)，可由不同專業(yè)的專家組成的分子腫瘤專家組給出個(gè)體化治療方案。使用LDTs的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)配備“濕實(shí)驗(yàn)”和“干實(shí)驗(yàn)”研發(fā)人員，其應(yīng)具有正確設(shè)定腫瘤體細(xì)胞突變NGS檢測(cè)臨床預(yù)期用途、建立檢測(cè)系統(tǒng)（含試劑配制和生物信息分析流程搭建等）及其使用SOPs以及完成LDTs性能確認(rèn)的能力。
共識(shí)3
實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)的臨床預(yù)期用途為通過體細(xì)胞基因突變檢測(cè)選擇可能在靶向或免疫治療藥物使用中受益的患者以及耐藥監(jiān)測(cè)。臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)在預(yù)期用途中包括但不限于適用人群、樣本類型、檢測(cè)基因及其突變位點(diǎn)或突變類型和檢測(cè)的臨床意義等。在NGS方法學(xué)建立和優(yōu)化階段，實(shí)驗(yàn)室需根據(jù)臨床預(yù)期用途，選擇具有臨床意義的待測(cè)基因位點(diǎn)；優(yōu)化核酸提取方法，所提取核酸的質(zhì)量應(yīng)滿足檢測(cè)要求；建立和優(yōu)化文庫制備方法；對(duì)測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行性能確認(rèn)，建立測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)不同突變類型的性能指標(biāo)；搭建和優(yōu)化生物信息學(xué)分析流程，確定測(cè)序深度和陽性判斷值，并對(duì)生物信息學(xué)分析流程進(jìn)行性能確認(rèn)。
共識(shí)4
使用NMPA 批準(zhǔn)的NGS試劑進(jìn)行檢測(cè)前應(yīng)進(jìn)行分析性能驗(yàn)證；LDTs試劑應(yīng)根據(jù)臨床預(yù)期用途進(jìn)行試劑方法的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，至少要對(duì)體細(xì)胞基因突變的識(shí)別策略、樣本前處理、核酸提取、文庫制備、靶向捕獲、高通量測(cè)序平臺(tái)、生物信息學(xué)分析、測(cè)序深度和陽性判斷值等環(huán)節(jié)進(jìn)行確認(rèn)。在完成試劑方法的設(shè)計(jì)和優(yōu)化后，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)LDTs檢測(cè)的全流程進(jìn)行整體的性能確認(rèn)。分析性能確認(rèn)應(yīng)至少證明NGS對(duì)各種不同突變類型的檢測(cè)能力，證明對(duì)重要常見基因的檢測(cè)能力。如果臨床實(shí)驗(yàn)室可接收多個(gè)樣本類型，那么對(duì)每種樣本類型均需分別進(jìn)行性能確認(rèn)。沒有足夠的臨床樣本，可以使用模擬樣本來代替。分析性能確認(rèn)包括但不限于精密度、準(zhǔn)確度、分析敏感性、分析特異性和可報(bào)告范圍等。在確認(rèn)分析性能特征可以滿足臨床預(yù)期用途后，最終完成建立“濕實(shí)驗(yàn)”試劑配制和“干實(shí)驗(yàn)”生物信息學(xué)分析流程SOPs。對(duì)預(yù)期用途為伴隨診斷的NGS檢測(cè)需進(jìn)行臨床性能確認(rèn)。性能評(píng)價(jià)應(yīng)包含檢測(cè)范圍內(nèi)樣本類型和突變類型。通過性能評(píng)價(jià)，建立性能參數(shù)，明確檢測(cè)的局限性。若實(shí)驗(yàn)室流程發(fā)生改動(dòng)，需根據(jù)對(duì)檢測(cè)的影響進(jìn)行全面或部分性能確認(rèn)。
共識(shí)5
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定每一種類型樣本采集、運(yùn)送、接收和保存的SOPs，明確樣本接收和拒收標(biāo)準(zhǔn)，建立合適的樣本運(yùn)輸和保存要求。適用于腫瘤基因突變NGS檢測(cè)的樣本主要包括FFPE、血漿、新鮮組織、胸腹水等。采用FFPE、胸腹水細(xì)胞沉淀或新鮮組織進(jìn)行NGS檢測(cè)前，需先評(píng)估樣本質(zhì)量和腫瘤細(xì)胞的含量。為避免交叉污染，切片制備過程中，應(yīng)使用一次性耗材。血漿樣本采集、運(yùn)送、接收和保存的核心是避免外周血有核細(xì)胞裂解釋放基因組DNA 稀釋游離DNA 或游離DNA 降解。分析前記錄的關(guān)鍵點(diǎn)為樣本接收、拒收和預(yù)處理的記錄。當(dāng)樣本質(zhì)量未達(dá)到SOPs要求時(shí)，可進(jìn)行讓步檢測(cè)，但應(yīng)建立對(duì)應(yīng)的異常情況處理程序。
共識(shí)6
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)性能確認(rèn)或性能驗(yàn)證的結(jié)果，建立分析中檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。各環(huán)節(jié)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)準(zhǔn)操作程序的重要組成，包括核酸提取后，核酸濃度、核酸純度和核酸的片段分布要求，文庫制備的DNA上樣量和文庫制備后進(jìn)行雜交捕獲上樣量的要求，最低測(cè)序深度、平均測(cè)序深度、覆蓋均一性、GC含量、堿基識(shí)別質(zhì)量值、比對(duì)質(zhì)量值和在靶率等要求，這些要求也同時(shí)是分析中實(shí)驗(yàn)記錄的關(guān)鍵點(diǎn)。若某一關(guān)鍵環(huán)節(jié)的檢測(cè)質(zhì)量控制參數(shù)不符合要求，則實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)所建立的異常情況的處理程序進(jìn)行處理。此外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)可檢測(cè)的樣本類型、突變類型、檢測(cè)下限等設(shè)置合適的包括所檢測(cè)的所有突變類型的弱陽性、陰性和無模板對(duì)照（如水樣本）質(zhì)控品，且與待檢樣本同批檢測(cè)。定期參加EQA/PT或進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)等。出現(xiàn)失控，應(yīng)分析失控原因，并采取相應(yīng)的糾正措施和預(yù)防措施。
共識(shí)7
腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)結(jié)果報(bào)告應(yīng)對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)說明。腫瘤體細(xì)胞基因突變可以分為臨床意義明確、有潛在臨床意義、臨床意義不明確和良性或可能良性突變四級(jí)，臨床證據(jù)等級(jí)有A、B、C和D級(jí)。實(shí)驗(yàn)室需要建立分級(jí)和報(bào)告的SOPs，明確對(duì)體細(xì)胞基因突變進(jìn)行分級(jí)的流程和在日常檢測(cè)中報(bào)告哪一級(jí)或哪幾級(jí)突變位點(diǎn)。分級(jí)的流程應(yīng)有記錄，包括證據(jù)來源的指南、文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫，證據(jù)等級(jí)，分級(jí)結(jié)果等。
共識(shí)8
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)體細(xì)胞基因突變藥物療效預(yù)測(cè)的臨床意義進(jìn)行解釋。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定結(jié)果解釋的SOPs，并遵循準(zhǔn)確、及時(shí)和充分的原則。在需要的情況下，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)給出進(jìn)一步檢測(cè)的建議。由于樣本質(zhì)量或其他質(zhì)量要求未達(dá)到，但樣本有限的情況進(jìn)行的讓步檢測(cè)，也應(yīng)在報(bào)告中進(jìn)行說明。與腫瘤無關(guān)的意外發(fā)現(xiàn)因難以解釋，建議不在檢測(cè)報(bào)告中進(jìn)行呈現(xiàn)。在對(duì)如結(jié)直腸癌、卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌等具有遺傳傾向的腫瘤進(jìn)行NGS檢測(cè)時(shí)，需結(jié)合家族史，考慮是否為遺傳性腫瘤，并建立遺傳咨詢流程。
推動(dòng)腫瘤的精準(zhǔn)診療
NGS技術(shù)在腫瘤的精準(zhǔn)診療中具有重要作用，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)質(zhì)量管理，保證NGS檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。《高通量測(cè)序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識(shí)（第一版腫瘤部分）》對(duì)實(shí)體腫瘤體細(xì)胞基因突變NGS檢測(cè)中的臨床預(yù)期用途確定、方法建立與優(yōu)化、LDTs性能確認(rèn)、分析前中后的質(zhì)量保證關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行了闡述。目前，實(shí)體腫瘤基因突變NGS突變檢測(cè)主要用于腫瘤靶向用藥指導(dǎo)及其耐藥監(jiān)測(cè)和免疫治療療效評(píng)估。
對(duì)于實(shí)體腫瘤胚系變異NGS檢測(cè)的相關(guān)內(nèi)容，可參考同期發(fā)布的《高通量測(cè)序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識(shí)（第一版遺傳病部分）》［2］。
參考文獻(xiàn)
【1】北京市臨床檢驗(yàn)中心等. 高通量測(cè)序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識(shí)（第一版腫瘤部分）. 中華醫(yī)學(xué)雜志.2020,100(9):648-659.
【2】北京市臨床檢驗(yàn)中心等. 高通量測(cè)序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識(shí)（第一版遺傳病部分）. 中華醫(yī)學(xué)雜志.2020,100(9):660-668.
【3】北京市臨床檢驗(yàn)中心等. 高通量測(cè)序技術(shù)臨床檢測(cè)規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識(shí)（第一版通用部分）.中華醫(yī)學(xué)雜志.2019,99(43):3393-3397.
