2020年2月12日0時-24時，湖北新增新冠肺炎病例14840例，較前幾日大幅增加，引發(fā)民眾大量討論。這一日新增病例數(shù)字之所以如此驚人，是因為湖北省將臨床診斷病例數(shù)納入確診病例數(shù)進行公布。那么，有人要問了：是不是核酸檢測不能成為診斷新冠肺炎的依據(jù)呢？根據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》，在湖北省的病例診斷分類中雖然增加了“臨床診斷”，但是確診病例診斷標準并沒有變：
1. 需有呼吸道標本或血液標本行實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性；
2. 或病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源。
由此可見，病毒核酸檢測仍是確診感染的“金標準”。
其實，自1月10日武漢新型冠狀病毒基因組序列被首次破譯并對外公布以來，國內(nèi)眾多科學工作者及IVD廠商迅速組織開展新型冠狀病毒檢測試劑的研發(fā)工作，檢測試劑盒研制成功的好消息不斷從全國各地傳出，檢測所需時間也一再縮短，為診斷新冠病毒肺炎提供了有力的支持。這些檢測試劑盒運用的檢測方法不盡相同，主要包含以下幾種：熒光定量PCR（qRT-PCR）、片段分析、高通量測序（NGS）以及特異抗體檢測等。為全面了解這幾種檢測方法在新冠病毒診斷不同方面的應(yīng)用，本文對這幾種檢測方法做簡要介紹：
以2019-nCoV新型冠狀病毒的高度特異性序列為靶區(qū)域，設(shè)計特異性引物和熒光探針，通過多重熒光PCR擴增，實現(xiàn)對2019-nCoV新型冠狀病毒RNA的檢測。這種方法也是目前新冠病毒檢測試劑盒中最常用的檢測方法。靈敏度及特異性都很高，檢測時間在2h左右。同時，這種方法對樣本采集以及檢測實驗室規(guī)范要求很高。若樣本采集不到位，標本所帶病毒量較少；實驗操作失誤，造成病毒RNA降解，易造成檢測出現(xiàn)“假陰性”。為解決此問題，可在試劑盒中加入內(nèi)源性內(nèi)參的引物探針，用內(nèi)源性內(nèi)參的結(jié)果來質(zhì)控標本采集提取及實驗操作流程是否無誤。
以2019-nCoV新型冠狀病毒的高度特異性序列為靶區(qū)域，設(shè)計特異性逆轉(zhuǎn)錄引物及擴增引物，進行普通PCR擴增，PCR產(chǎn)物采用Sanger測序儀的片段分析功能進行檢測，根據(jù)在目標片段長度位置是否出現(xiàn)檢測峰為依據(jù)進行結(jié)果判斷。此方法可根據(jù)不同待檢病毒靶標設(shè)計不同目標長度的產(chǎn)物，進行多靶標檢測，進而區(qū)分患者感染的是哪種冠狀病毒，做到冠狀病毒的分型檢測。
高通量測序技術(shù)通過對待測目標的文庫構(gòu)建，測序，序列拼接比對獲得待測目標基因組序列的全貌。對在此次武漢疫情爆發(fā)初期，通過構(gòu)建宏基因組文庫進行NGS測序鑒定出新型冠狀病毒，并成功繪制出其全基因組序列信息。迅速判斷出此次爆發(fā)的冠狀病毒為一種新的冠狀病毒，與SARS病毒序列高度相似。正是有了新冠病毒全基因組信息，才能使國內(nèi)科學家及診斷企業(yè)研發(fā)熒光定量試劑盒用于新冠病毒的檢測。目前，到了疫情攻堅戰(zhàn)的此刻，新冠病毒溯源、流行、變異規(guī)律、變異監(jiān)測、分子流行病學、人類感染的發(fā)病機理等尚待進一步明確。
這時，NGS技術(shù)在解析病毒變異情況和追蹤病毒起源及演化方面，扮演著不可替代的核心作用。
此次2019-nCoV病毒為RNA病毒，在傳播過程存在發(fā)生變異的可能性，并在一定程度上將影響RT-PCR的敏感性，采用高通量測序方法則可解決這一問題，并監(jiān)測到可能的病毒變異。部分病毒含量較低的樣本，在低于RT-PCR最低檢出限時，采用高通量測序方法則可以提高陽性檢出率，避免漏檢和錯檢；對于疑似感染、多重感染或繼發(fā)感染病原，采用高通量測序方法則可進行并發(fā)檢測，提供更多可能感染的病原信息。
總之，從測定未知病原，到鑒定已知序列，再到陽性樣本的結(jié)果確認以及可能存在的序列變異動態(tài)監(jiān)控，都可以采用NGS方法有效應(yīng)對。但NGS方法對實驗室及實驗人員操作要求是這幾個檢測方法中最高的。
抗體是機體感染病毒后，體液免疫應(yīng)答的產(chǎn)物。通常，免疫球蛋白M(IgM)抗體在感染早期出現(xiàn),免疫球蛋白G(IgG)抗體在感染中晚期出現(xiàn)。通過血清學檢測，利用抗原抗體的特異性結(jié)合原理，配合標記物顯色篩查，實現(xiàn)對人體血清、血漿或全血中新型冠狀病毒IgM/IgG抗體的體外定性檢測。
簡言之，檢測特異抗體也可以明確患者是否“近期或既往感染過新型冠狀病毒”，有助于核酸檢測陰性但臨床上疑似患者的確診。其主要優(yōu)點在于現(xiàn)場即時診斷，不要任何檢測設(shè)備，具備快速、便捷、高效檢測的特點，可用于社區(qū)基層醫(yī)院甚至家庭的早期初步篩查。
另一方面，核酸檢測多采用上呼吸道樣本（咽拭子為主），采集過程對于醫(yī)護人員暴露風險極大，而抗體檢測是通過血液樣本檢測，感染風險降低。但抗體檢測容易受到血液標本中的一些干擾物質(zhì)（如非特異IgM、類風濕因子、溶血所致的高濃度度血紅蛋白等）的存在而出現(xiàn)“假陽性”結(jié)果，所以抗體檢測必須采用IgM 和IgG同時檢測且通常需多次動態(tài)檢測來確認。
因此，特異抗體檢測陽性不能像病毒核酸檢測陽性一樣作為病毒感染的“金標準”。
每種檢測方法都有各自的優(yōu)缺點，為防止錯檢、漏檢，應(yīng)綜合考慮適用場所、人群及疑似患者病毒攜帶量等問題，必要時根據(jù)臨床診斷進行選擇。精準的qRT-PCR檢測，配合必要的基因測序復核及抗體水平的評估是診斷新冠病毒最佳組合。
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