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在《Base editing correction of hypertrophic cardiomyopathy in human cardiomyocytes and humanized mice》文章中，確定了一個(gè)腺嘌呤堿基編輯器（ABEs）和單鏈向?qū)NA（sgRNA）系統(tǒng)，在選定的位點(diǎn)以最小限度的旁觀者編輯（bystander editing）和脫靶編輯可以有效地糾正MYH7基因上的p.R403Q致病變異（PV）。結(jié)果表明，在源自肥厚型心肌病（HCM）患者的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSc）心肌細(xì)胞和HCM人源化小鼠模型中，堿基編輯成分的傳遞可挽救HCM的病理表現(xiàn)。該研究證明了堿基編輯在治療遺傳性心臟病方面的潛力，并促進(jìn)了腺嘌呤堿基編輯器療法的進(jìn)一步發(fā)展，以糾正導(dǎo)致心臟病的單基因變異。

最常見的遺傳性心臟病是肥厚型心肌病（HCM），它是由編碼心肌肌小節(jié)相關(guān)蛋白的基因變異引起，并導(dǎo)致異常的心肌肥厚。HCM的并發(fā)癥包括心力衰竭、心律失常和心原性猝死。MYH7（編碼β-肌球蛋白）的顯性負(fù)向c.1208G>A（p.R403Q）變異是一種常見且研究充分的PV，可導(dǎo)致心臟收縮力增加和HCM發(fā)病。

HCM患者iPSCs的ABE糾正效率

為了將ABEmax-VRQR和h403_sgRNA系統(tǒng)應(yīng)用于疾病模型，研究人員從2名攜帶MYH7^403/+ PV（HCM1^403/++和HCM2^403/+）的HCM患者中獲得了人類iPSCs。通過ABEmax-VRQR-P2a-EGFP和h403_sgRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、GFP+細(xì)胞熒光激活細(xì)胞分選來糾正MYH7^403/+變異（圖1a）。通過高通量測序（HTS），盡管有98%-99%的靶點(diǎn)編輯，但在使用生物信息學(xué)工具CRISPOR后確定的8個(gè)檢測候選脫靶基因座的所有58個(gè)腺嘌呤堿基上，脫靶DNA編輯極少甚至沒有（0.12%或更少）（圖1b）。結(jié)果表明，具有ABEmax-VRQR的h403_sgRNA可以有效且特異性地糾正目標(biāo)致病性錯(cuò)義變異，在檢測的脫靶位點(diǎn)僅需極少的旁觀者編輯和很少或沒有DNA編輯。

ABE編輯患者來源iPSC-CMs的功能分析

為了研究基因編輯糾正是否能減少HCM患者的超收縮力的產(chǎn)生，研究人員將iPSC-CMs以單細(xì)胞密度放置在柔軟的聚二甲基硅氧烷表面上，記錄心肌細(xì)胞（CMs）收縮的高幀率視頻并計(jì)算峰值收縮力（圖1c）。由于先前的研究表明p.R403Q HCM變異導(dǎo)致ATP消耗增加和細(xì)胞代謝改變，接著又通過基因編輯糾正后的代謝通量測定評(píng)估細(xì)胞能量學(xué)的變化（圖1d）。結(jié)果表明，在人類HCM的CMs中，PV的糾正足以挽救超收縮表型并恢復(fù)正常的細(xì)胞能量。

圖1. 基于堿基編輯糾正的HCM患者iPSC-CM的功能分析

HCM生物學(xué)人源化小鼠模型的建立

與人類心臟中主要表達(dá)的β-肌球蛋白重鏈異構(gòu)體不同，成年小鼠心臟主要表達(dá)α-肌球蛋白重鏈異構(gòu)體，由MYH6編碼。以往的HCM小鼠模型都是用MYH6突變直接替代MYH7突變以解釋表達(dá)差異，但這二者在蛋白編碼區(qū)并不是完全相同的，因此用于人類基因組的sgRNA和編輯策略無法直接應(yīng)用至小鼠模型。為了使用人類序列特異性堿基編輯策略進(jìn)行臨床前研究，研究人員建立了一個(gè)人源化小鼠模型，在小鼠MYH6基因中包含MYH7 c.1208G>A（p.R403Q）人類錯(cuò)義變異，該基因也具有PV上游和下游的至少21個(gè)核苷酸的人類DNA序列同一性，以便檢測人類基因組特異性CRISPR策略。另一個(gè)MYH6等位基因包含未修飾的小鼠基因組序列。這種人源化小鼠模型（MYH6^h403/+）反映了先前描述的MYH6 p.R403Q小鼠模型的表型。

人類HCM小鼠模型的體內(nèi)ABE治療

研究人員首先試圖通過挽救MYH6^h403/h403小鼠來驗(yàn)證雙AAV9 ABE系統(tǒng)的效率，這些小鼠在出生后一周內(nèi)就會(huì)死亡。值得注意的是，目前沒有報(bào)道人類患者具有純合子基因型。用生理鹽水、低劑量（4×1013 vg kg-1）或高劑量（1.5×1014 vg kg-1）的AAV9（低劑量共為8×1013 vg kg-1，高劑量共為3×1014 vg kg-1）向P0（出生后第0天）的MYH6^h403/h403幼崽胸腔內(nèi)注射，并監(jiān)測其發(fā)育情況。結(jié)果MYH6^h403/+和MYH6^WT小鼠在斷奶后存活并進(jìn)入成年。高劑量小鼠心臟的互補(bǔ)DNA（cDNA）的Sanger測序表明，在轉(zhuǎn)錄水平上致病性核苷酸糾正了35%，這表明雙AAV9 ABE系統(tǒng)能夠在心臟中進(jìn)行基因編輯（圖2）。

由于MYH7 p.R403Q變異僅以雜合形式存在于人類患者中，接下來又設(shè)置了雙AAV9 ABE系統(tǒng)來預(yù)防MYH6^h403/+小鼠中HCM疾病的發(fā)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與MYH6^WT對照組相比，MYH6^h403/+小鼠的HCM特征增加，包括舒張期左室前壁（LVAW）厚度增加和舒張期左室后壁（LVPW）厚度增加。這些小鼠在舒張期和收縮期的左室內(nèi)徑減小，左室射血分?jǐn)?shù)（EF）和左室縮短分?jǐn)?shù)（FS）增加。MYH6^h403/+小鼠的心室壁厚度增加，心室直徑減小以及正常高值FS，這與人類患者的臨床進(jìn)展一致。這些數(shù)據(jù)表明，雙AAV9 ABE系統(tǒng)治療足以預(yù)防HCM介導(dǎo)的心臟病理性重塑的發(fā)生（圖2）。

圖2. 對Myh6h403/+小鼠進(jìn)行雙AAV9 ABE系統(tǒng)編輯預(yù)防HCM

而在《Efficient in vivo genome editing prevents hypertrophic cardiomyopathy in mice》文章中，研究人員構(gòu)建了可模擬人類肌球蛋白R(shí)403Q突變的小鼠模型，其病理特征和人類疾病表現(xiàn)類似，包括左心室肥大、心室腔縮小以及心肌纖維化。基于該動(dòng)物模型，研究人員評(píng)估了兩種不同的基因療法——腺嘌呤堿基編輯器（ABE8e）和由AAV9遞送的強(qiáng)效Cas9核酸酶，來預(yù)防攜帶雜合HCM致病變異肌球蛋白R(shí)403Q的小鼠發(fā)生心臟病變。利用單劑量的AAV9雙載體，每個(gè)載體攜帶一半的RNA引導(dǎo)的ABE8e，糾正了≥70%的心室心肌細(xì)胞的致病變異，并保持了持久且正常的心臟結(jié)構(gòu)和功能。額外的劑量雖然提升了心房處的編輯效率，但也增加了旁觀者編輯現(xiàn)象的發(fā)生。RNA引導(dǎo)的Cas9核酸酶的AAV9遞送有效地滅活了致病等位基因，但由于劑量依賴性的毒性，需要一個(gè)狹窄的治療窗口來維持健康。這些臨床前研究表明，單劑量基因療法在糾正或沉默致病變異、預(yù)防HCM發(fā)展方面具有相當(dāng)大的潛力（圖3）。

圖3. 致病性變異R403Q的AAV9-Cas9沉默和R403Q-129SvEv小鼠的心臟功能

以上兩項(xiàng)基于基因編輯的新精準(zhǔn)療法的臨床前研究，為HCM模型的成功基因編輯提供了希望，雖然將其轉(zhuǎn)化為人類患者還需面臨各種挑戰(zhàn)，但單劑量明確的治療方法不僅適用于HCM，也適用于基因敲除或過度表達(dá)策略不適用的眾多其他遺傳性綜合征，因此是一個(gè)非常值得追求的目標(biāo)。在未來，基因編輯應(yīng)用于臨床的精準(zhǔn)治療指日可待！

參考文獻(xiàn)

[1] Chai AC, Cui M, Chemello F, et al. Base editing correction of hypertrophic cardiomyopathy in human cardiomyocytes and humanized mice. Nat Med, 2023 Feb; 29(2): 401-411.

[2] Reichart D, Newby GA, Wakimoto H, et al. Efficient in vivo genome editing prevents hypertrophic cardiomyopathy in mice. Nat Med, 2023 Feb; 29(2): 412-421.